1前言
1.1研究目的和意義
高血壓是一種常見的心腦血管疾病，會引起心血管、大腦、腎臟的病變
[1]。降壓肽是一種ACE抑制劑，通常用于高血壓患者的治療
[2]。目前，對高血壓患者的治療通常使用化學合成的藥物，然而，這些合成藥物有一些副作用,包括咳嗽和皮疹
[3]。食源性降壓肽來源于天然植物，無副作用，易被人體吸收
[4]。不同的植物來源，降壓功效作用也是不同的。
核桃 (核桃) 蛋白質的具有廣闊應用前景的新產品和強化身體的好來源
[5]。核桃粕是核桃經過提取油后的副產物，含有29.65%蛋白質，提油后的核桃粕多數被用作飼料，資源造成了一定的浪費，酶解核桃粕蛋白制備降壓肽可以促進核桃粕的深加工，實現資源的綜合利用。本文采用兩種不同的蛋白酶共同作用水解蛋白，采用雙酶復合水解可以增加蛋白酶的特異性催化位點
[6]，可以提高可溶性蛋白含量及功能性多肽的產量和轉化率
[7]，并且增大了蛋白的水解度，也一定程度上增大了蛋白原料對肽的轉化率，進而可以改善蛋白質水解液中功能性多肽的特性。本實驗將兩種蛋白酶分兩步進行酶解，全面研究雙酶分步酶解工藝制備核桃粕降壓活性肽的工藝及參數，然后用響應面法對其工藝進行優化。
1.2降壓肽的研究進展
日本是對食源性降血壓肽研究**多的**家，且已經有此類降血壓肽的商品上市，以其天然無毒的特性受到了廣大消費者的信賴，而我**在此項的研究才剛剛起步
[8]，目前臨床上的高血壓的藥物治療盡管有效可是也存在弊端，如降壓過度、泌尿系統發生病變、持續性咳嗽、味覺失真和血管神經性水腫等，而通過蛋白酶的水解獲得的具有降血壓活性的多肽不僅可以對高血壓患者起到降血壓的作用，對身體體質沒什么影響，適合患者長期服用。隨著**民生活水平的提高，人們的自我保健意識和安全意識也在逐漸加強，這種降血壓肽會逐漸被人們接受，成為預防，緩解和治療高血壓的一個有效手段。
2 材料與方法
2.1 材料和設備
核桃粕，康福壽核桃油加工有限公司；2709堿性蛋白酶(Alcalase)購于北京博奧拓達科技有限公司；風味蛋白酶購于sigma公司；FAPGG，呋喃丙烯酰三肽，購于sigma公司；ACE，血管緊張素轉換酶，購于sigma公司；正己烷、鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉等均為分析純。試驗用水均為去離子水。
快速恒溫數顯水浴鍋 金壇市醫療儀器廠；PHS-3 C雷磁pH計 上海精科；BS 2000 S電子天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司；FDU-1200冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠；ELx 808酶標儀 Thermo公司；SH 21-1磁力攪拌器 上海梅穎浦儀表制造有限公司；DNP-9272電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司。
2.2 工藝流程
低溫脫脂核桃粕→過60目篩→脫脂→提取核桃蛋白→堿性蛋白酶和風味蛋白酶聯合酶解條件的優化→核桃ACE抑制肽
2.3 核桃脫脂粉的制備
核桃粕經粉碎后過60目篩，用正己烷以1:5(w/v)的料液比在磁力攪拌器上提取1h后進行抽濾，取濾渣重復用正己烷提取**濾液無色透明時收集濾渣，然后用恒溫干燥箱烘干溶劑，置于冰箱4℃冷藏備用。
2.4 核桃蛋白的提取
采用堿溶酸沉法提取核桃蛋白。參照毛曉英
[9]的方法，略改。以購買的核桃脫脂粕為原料，將其烘干后粉碎，然后通過95%醇洗(1:10,(w/v))，過濾，把濾餅置恒溫干燥箱烘干溶劑。然后用去離子水配制蛋白質溶液(1:26,(w/v))，調節蛋白液的pH值到11.0，置磁力攪拌器上53℃攪拌1.5h后7000r/min 25℃離心15min，取上清液，調節pH**4.5，攪拌1h，7000r/min 25℃離心15min，水洗沉淀，調節pH**中性后凍干，置于冰箱4℃冷藏備用。
2.5 水解蛋白酶的篩選
表1 四種商業酶**適作用條件和酶活力
Table 1 The optimum hydrolysis conditions and the enzymatic activity of four commercial enzymes
|
酶種類 |
**適pH |
**適溫度(℃) |
酶活力(U/g) |
|
堿性蛋白酶 |
8.5 |
55 |
7.1×104 |
|
中性蛋白酶 |
7.0 |
40 |
6.3×105 |
|
風味蛋白酶 |
6.5 |
50 |
2.0×104
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